蛋白質經水解或酶解可由大分子變成小的pro成分，如水解后的產物經胨，肽等最后成為氨基酸，氨基酸是構成pro最基本的物質。

　　水解后的pro和水解前的pro在物理特性，化學結構以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差別與水解的程度有密切關系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以評價食品的營養價值。

　　氨基酸不是單純的一種物質，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸(儀器價格昂貴，不能普遍使用)，對于食品來說有時有很多種氨基酸可以同時存在于一種食品中，所以需要測定總的氨基酸量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸態氮)的百分率表示，當然，如果食品中只含有一種氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以從含氮量計算出氨基酸的含量。

　　食品在評價蛋白質的營養價值時，除了測定pro的含量，氨基酸氮含量，還需要對各種氨基酸進行分離，鑒定，尤其對8種人體必需氨基酸進行定量定性分析。

　　一.單指示劑甲醛滴定法：轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com

　　1原理：氨基酸具有酸，堿兩重性質，因為氨基酸含有-COOH基，而-COOH基顯示酸性，又含有-NH2，-NH2則顯示堿性，由于-COOH基和-NH2的相互作用，使氨基酸成為中性的內鹽，當加入甲醛溶液時，-NH2與甲醛結合，其堿性消失，破壞內鹽的存在，就可用堿來滴定-COOH基，以間接方法測定氨基酸的量，反應式以三種形式存在。

　　用堿完全中和-COOH基時的PH值為8.4~9.2。

　　2試劑：轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com

　　(1)40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，將甲醛用1N NaOH溶液中和(淡蘭色)。(2)0.1%百里酚酞乙醇溶液。

　　(3)0.100N NaOH標準溶液。

　　3操作步驟：

　　稱約含20mg左右的氨基酸→于燒杯中(如為固體樣加水50ml)→加兩滴指示劑→用0.1N NaOH溶液滴定到淡蘭色→加中性甲醛20ml→搖勻→靜置1分鐘→此時蘭色應消失→再用0.1N NaOH溶液滴定淡蘭色，記錄兩次滴定所消耗的堿液毫升數。

　　計算：氨基酸態氮=(N×V×0.014×100)/W×100

　　二.雙指示劑甲醛滴定法

　　1原理：轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com

　　與單色法相同，只是在此法中使用了兩種指示劑，從分析結果看，雙指示劑甲醛滴定法與亞硝酸氮氣容量法(此法操作復雜，但準確，不作介紹)相近，單色滴定法稍偏低，主要因為單指示劑甲醛滴定法是以氨基酸溶液的PH值作為中性紅的終點，PH值為7.0，從理論計算看，雙色滴定法比單色滴定法準確。

　　2試劑：同單指示劑一樣，多一個0.1%中性紅(50%乙醇溶液)

　　3操作步驟：

　　取相同兩份樣品→分別于100ml三角瓶→一份加中性紅2滴→用0.1N NaOH滴定終點(由紅

　　變琥珀色)，記錄用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→搖勻→用0.1N

　　NaOH 滴至淡蘭色。

　　計算：

　　氨基酸態氮=(N×(V2-V1)×0.014×100)/W×100

　　V1——用中性紅為指示劑時，堿液所消耗的體積

　　V2——用百里酚酞乙醇液為指示劑時標液消耗量

　　0.014——氮的毫克當量濃度

　　注意事項：轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com

　　(1)單色指示劑甲醛滴定法，用堿完全中和—COOH基時的pH為8.5—9.5

　　(2)測定樣品的顏色較深，應加活性炭脫色之后再滴定

　　三.茚三酮比色法：

　　1原理：氨基酸在一定pH范圍內，能與茚三酮生成蘭紫色化合物。可以用比色法定量測定。

　　2試劑：

　　(1)磷酸緩沖液(pH.8.04)制備方法如下：

　　稱磷酸二氫鉀4.5350g。定容500ml

　　稱NAH2PO4·12H2O 11.9380g分別溶解定容500ml

　　取磷酸二氫鉀10ml與磷酸氫二鈉190ml混合即為pH8.04的緩沖液

　　(2)2%茚三酮溶液：轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com

　　稱茚三酮1g→溶于35ml熱水→加入40mg氯化亞錫(SnCl2·H2O)攪拌過濾(作防腐劑)→于冷暗處過夜→定容50ml

　　① 氨基酸標液

　　稱干燥氨基酸(如異亮氨酸)0.2000g→溶解定容100ml→搖勻→吸10ml于另外100ml容量瓶采集者退散

　　定容100ml，即得200Ug/ml標液

　　3操作方法：

　　(1)繪制標準曲線：

　　取7個25ml容量瓶，吸取標液 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于7個25ml容量瓶，加水補充

　　至容積為4ml，然后加茚三酮和緩沖液各1ml，于水浴加熱15分鐘，冷卻后定容25ml，靜置

　　15分鐘，在570nm下測消光值，繪制標準曲線。

　　(2)樣品測定：

　　取樣品5.00~10.0g(液體樣5-10ml)→于燒杯中→加50ml水和活性碳約5g→加熱過濾→用

　　30—40ml熱水洗滌活性炭→吸澄清樣液1~4ml→加茚三酮和緩沖液各1ml水浴加熱15分鐘，

　　冷卻定容，靜置15分鐘于570nm下測定消光值，按下式計算氨基酸含量。

　　氨基酸含量(毫克/100克)=C/(W×1000)×100轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com

　　C——從標準曲線上查得得氨基酸的量(Ug)

　　W——測定得樣品溶液相當于樣品的量(g)

　　注意事項：

　　茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深紅色，使用前要進行純

　　化，方法如下：、

　　取10g茚三酮容于40ml熱水中，加一克活性炭，搖勻靜置30分鐘，過濾，將濾液放入冰箱中

　　過濾，即出現蘭色結晶，過濾，用2ml冷水洗滌結晶，置干燥皿中干燥，裝瓶備用。

　　思考題：

　　1 試述蛋白質測定中，樣品消化過程所必須注意的事項，消化過程中內容物顏色發生什么變化?為什么?

　　2 樣品經消化進行蒸餾前，為什么要加入氫氧化鈉?這時溶液發生什么變化?為什么?如果沒有變化，說明什么問題?須采用什么措施?

　　3 硫酸銅及硫酸鉀在測定中起了什么作用?

　　4 試述氨基酸態氮的測定原理。

　　5 結果計算中為什么要乘上蛋白質系數?

　　實驗：①水果中酸度的測定。轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com轉自環 球 網校edu24ol.com

　　②糕點中和脂肪的測定。

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