在手術過程中，雖然器械和物品都已滅菌、消毒，手術人員也已洗手、消毒、穿戴無菌手術衣和手套，手術區又已消毒和鋪覆無菌布單，為手術提供了一個無菌操作環境。但是，在手術進行中，如果沒有一定的規章來保持這種無菌環境，則已經滅菌和消毒的物品或手術區域仍有受到污染，引起傷口感染的可能，有時可能使手術失敗，甚至影響病人的生命。這個所有參加手術的人員必須認真執行的規章，即稱無菌操作規則，如發現有人違反時，必須立刻糾正。無菌操作規則包括： 

　　1.手術人員一經“洗手”，手臂即不準再接觸未經消毒的物品。穿無菌手術衣和戴無菌手套后，背部、腰部以下和肩部以上都應認為是有菌地帶，不能接觸；同樣，手術臺邊緣以下的布單，也不要接觸。 

　　2.不可在手術人員的背后傳遞器械及手術用品。墜落到無菌巾或手術臺邊以外的器械物品，不準拾回再用。 

　　3.手術中如手套破損或接觸到有菌地方，應另換無菌手套。前臂或肘部碰觸有菌地方，應更換無菌手術衣或加套無菌袖套。無菌巾、布單等物，如已被濕透，其無菌隔離作用不再完整，應加蓋干的無菌單。 

　　4.在手術過程中，同側手術人員如需調換位置時，應先退后一步，轉過身，背對背地轉到另一位置，以防止污染。 

　　5.手術開始前要清點器械、敷料，手術結束時，檢查胸、腹等體腔，核對器械、敷料數無誤后，才能關閉切口，以免異物遺留腔內，產和嚴重后果。 

　　6.切口邊緣應以大紗布墊或手術巾遮蓋，并用巾鉗或縫線固定，僅顯露手術切口。 

　　7.作皮膚切口以及縫合皮膚之前，需用70%酒精或0.1%新潔爾滅溶液，再涂擦消毒皮膚一次。 

　　8.切開空腔臟器前，要先用紗布墊保護周圍組織，以防止或減少污染。 

　　9.參觀手術人員不可太靠近手術人員或站得太高，也不可經常在室內走動，以減少污染的機會。