初級檢驗技士輔導：厭氧菌的分離與鑒定
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初級檢驗技士輔導：厭氧菌的分離與鑒定 $lesson$
厭氧菌的分離與鑒定
(一)直接鏡檢
根據形態和染色性，結合標本形狀與氣味，臨床工作中可初步判斷標本中可能有的細菌。
(二)分離培養
主要分初代培養和次代培養兩個階段，其中初代培養相對比較困難，關鍵在于厭氧環境和培養基的選擇。
初代培養的一般原則：
(1)先將標本涂片染色直接鏡檢，指導培養基的選擇。
(2)盡量選用在厭氧菌中覆蓋面寬的非選擇性培養基。
(3)最好多選1-2種覆蓋面不同的選擇性培養基。
(4)盡量保證培養基新鮮。
(5)要考慮到微需氧菌保存的可能。
1、選用適當的培養基接種：應接種固體和液體培養基。
(1)培養基的使用：應注意下列各點：
1)盡量使用新鮮培養基，2-4小時內用完;
2)應使用預還原培養基，預還原24-48小時更好。
3)可采用預還原滅菌法制作的培養基。
4)液體培養基應煮沸10分鐘，以驅除溶解氧，并迅速冷卻，立即接種。
5)培養厭氧菌的培養基均應營養豐富，并加有還原劑與生長刺激因子。
(2)培養基的選擇：初次培養一般都使用選擇培養基和非選擇培養基。
1)非選擇培養基：本培養基使分離的厭氧菌不被抑制，幾乎能培養出所有的厭氧菌。
2)選擇培養基：為有目的的選擇常見厭氧菌株，以便盡快確定厭氧的種類。
2、每份標本至少接種3個血平板，分別置于有氧，無氧及5%-10%CO2環境中培養，以便正確地培養出病原菌，從而判斷其為需氧菌、兼性厭氧菌、微需氧菌或厭氧菌中的哪一類。
3、厭氧培養法：
(1)厭氧罐培養法：在嚴密封閉的罐子里，應用物理或化學的方法造成無氧環境進行厭氧培養。常用冷觸酶法、抽氣換氣法，剛末法和黃磷燃燒法。
(2)氣袋法：利用氣體發生器產生CO2和H2，H2在觸媒的作用下與罐內的氧氣結合成水，從而造成無氧環境。
(3)氣體噴射法：本法是從培養基的制備到標本的接種直至進行培養的全過程，均在CO2的不斷噴射下進行。本法的關鍵是必須有無氧CO2。
(4)厭氧手套箱培養法：是迄今厭氧培養的最佳儀器之一，該箱由手套操作箱與傳遞箱兩部分組成，前者還附有恒溫培養箱，通過厭氧手套箱可進行標本接種、培養和鑒定等全過程。
(5)其他培養法：平板焦性沒食子酸法;生物耗氧法;高層瓊脂培養法。
4、厭氧狀態的指示：亞甲蘭和刃天青。
無氧時均呈白色，有氧時亞甲蘭呈藍色，刃天青呈粉紅色。
5、分離培養厭氧菌失敗的原因
1)培養前未做標本的直接涂片和染色鏡檢;
2)標本在空氣中放置太久或接種的操作時間過長;
3)未用新鮮配制的培養基;
4)未用選擇性培養基;
5)培養基未加必要的補充物質;
6)初代培養應用了硫乙醇酸鈉;
7)無合適的厭氧罐或裝備出現漏氣等問題;
8)催化劑失活;
9)培養時間不足;
10)厭氧菌的鑒定材料有問題。
6、鑒定實驗：可根據厭氧菌的菌體形態、染色反應、菌落性狀以及對某些抗生素的敏感性做出初步鑒定。最終鑒定則要進行生化反應及終末代謝產物等項檢查。
(1)形態和染色：可為厭氧菌的鑒定提供參考依據。
(2)菌落性狀：不同的厭氧菌其菌落形態和性質不同。梭菌的菌落特點是形態不規則，而無芽孢厭氧菌多呈單個的圓形小菌落。色素、溶血特點以及在紫外線下產生熒光的情況也可作為厭氧菌鑒定的參考依據。
1)色素：產黑色素類桿菌2~10天可產生黑色素;溶齒放線菌培養3~4天產生粉紅色色素。
2)溶血：產氣莢膜梭菌在新鮮的血瓊脂平板上可產生雙溶血環。
3)熒光：
(3)抗生素敏感實驗：常用的抗生素有卡那霉素及甲硝唑。卡那霉素可用于梭桿菌屬與類桿菌屬的區分，甲硝唑用于厭氧菌與非厭氧菌的區分。
(4)生化特性：主要包括多種糖發酵試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、觸酶試驗、卵磷脂酶試驗、脂肪酸酶試驗、蛋白溶解試驗、明膠液化試驗、膽汁肉湯生長試驗及硫化氫試驗等。目前有多種商品化的鑒定系統可以使用。
(5)氣液相色譜：可以利用該技術來分析厭氧菌的終末代謝產物，已成為鑒定厭氧菌及其分類的比較可靠的方法。