基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又稱為重組ＤＮＡ技術，是應用酶學方法，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組 裝成雜合分子，并使之在適當的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代DNA分子的過程。克隆（clone）一指含有單一的DNA重 組體的無性繁殖系，或指將DNA重組體引入宿主細胞建立無性繁殖系的過程(cloning)。　一個完整的基因克隆過程包括以下 步驟：１、 獲得待克隆的DNA片段（基因）；２、 目的基因與載體在體外連接；３、 重組DNA分子導入宿主細胞；４、 篩選、鑒定陽性重組子；５、 重組子的擴增與／或表達。

第一節 重組DNA中常用的工具酶 包括限制性核酸內切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉錄酶等，一、限制性內切酶的定義、命名和分類限制性核酸內切酶是識別并 切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。限制性核酸內切酶的來源：細菌的限制－修飾系統。分子克隆中所用的限制性核酸內切酶 屬于第Ⅱ類。限制性核酸內切酶的命名。二、限制性核酸內切酶的作用特點 1、識別位點的DNA序列呈二重旋轉對稱（即具有迥文結構）； 2、切割DNA均產生含5’-磷酸和3’-羥基的末端； 3、 錯位切割產生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿對稱軸切割雙鏈DNA產生平頭末端，也稱鈍性末端。 4、少數不同的限制酶可識別和切割相同的位點，這些酶稱為同切酶，如MboI Ⅰ和 Sau3A。三、其它工具酶參考“分子克隆”（Sambrook,J et al . molecular cloning）

第二節 載體－宿主系統 一、概述載體(vector)是攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增和表達的DNA,它們一般是通過改造質粒、噬菌體或病毒等構 建的。載體應具備以下條件：１、 能在適當的宿主細胞中復制；２、 具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆位點）以便外源DNA插入；３、 具有篩選標志以區別陽性與陰性重組分子；４、 載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體DNA與宿主DNA便于分離；５、 對于表達型載體還應具有與宿主細胞相適應的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。宿主細胞是基因克隆中重組DNA分子的繁殖 場所，適當的宿主細胞，必須符以下條件：１、 對載體的復制和擴增沒有嚴格的限制；２、 不存在特異的內切酶體系降解外源DNA；３、 在重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾；４、 重組缺陷型，不會產生體內重組；５、 容易導入重組DNA分子；６、 符合重組DNA操作的安全標準。二、質粒載體質粒(plasmid)是存在于細菌染色體外的小的共價、閉環雙鏈DNA分子，能自 主復制，并在細胞分裂時遺傳給子代細胞。質粒可賦予宿主細胞一些遺傳性狀如抗藥性等，通過質粒賦予細菌的表型可識別質粒的存在， 這是篩選重組轉化子的基礎。作為載體的質粒一般具有以下特點：１、 分子相對較小（３∽１０kb）；２、 松馳型復制；３、 具有適當的多克隆位點以便外源DNA插入；４、 具有插入失活篩選標志，便于從平板上直接篩選陽性重組子；５、 質粒能攜帶的外源DNA片段一般較小（<15kb）．三、λ噬菌體載體 λ噬菌體是一種雙鏈DNA噬菌體，基因組約為50kb+。線性λ噬菌體DNA分子的兩端各有12堿基的互補單鏈序列，是天然的粘 性末端，稱為COS位點。 λ噬菌體的生活周期：溶菌（裂解）生長時在平皿上形成清亮的噬菌斑；溶源性生長。 λ噬菌體的基因組：左臂長約20kb,含噬菌體頭、尾蛋白編碼基因；中央片段長約12-24kb,對噬菌體為非必需區；右臂長約 10kb,含λ噬菌體復制和溶菌相關蛋白的編碼基因。所有λ噬菌體載體均為通過切除非必需的中央區，并增減某些限制性酶切位點和 插入適當的篩選標記基因改造而成。已構建的λ噬菌體載體分為兩類：１、置換型載體：有兩個酶切位點或兩組排列相反的多克隆位點， 其間的DNA片段可被外源DNA置換。這類載體適于克隆5-20kb的外源基因片段，常用于構建基因組DNA文庫。２、插入型載 體：只有一個限制性內切酶位點或一組多克隆位點可供外源基因插入。這類載體允許插入5-7kb的外源DNA,適于構建cDNA文 庫。如λgt 噬菌體載體。一般將噬菌體DNA在體外包裝成病毒顆粒后再用于感染受體菌，這樣能大大提高轉染效率。四、Ｍ13絲狀噬菌體載體Ｍ 13基因組大小為6407bp，它是一種閉環的單鏈DNA分子，在感染細菌后呈雙鏈復制型DNA。因此用作克隆載體的雙鏈DNA 可從細菌中分離得到。在細菌中，雙鏈DNA復制100-200拷貝后就大量產生單鏈DNA,后者包裝成子代噬菌體顆粒，分泌到細 胞外，而不裂解細菌。在M13基因組中含507個核苷酸的非必需區，在這個區域插入外源DNA不會影響M13的繁殖和生存，現在 使用的M13載體如M13Mp18等均為對此區域進行改造而獲得。 M13克隆的最大問題是不能插入較大的外源ＤＮＡ片段（一般<1000bp）,但M13載體的優點是從細菌中釋放出來的噬 菌體顆粒中含有一條與克隆的模板DNA互補的單鏈，所以最適合于制備DNA測序時用的單鏈模板，另外也可用于制備單鏈特異性DN A探針。五、粘粒載體 粘粒（柯斯質粒）是指含有λ噬菌體粘性末端的雜種質粒，由λDNA的COS區(約20-數百bp)與質粒重組而成，在宿主細胞中 可作為正常噬菌體進行復制，但不表達任何噬菌體的功能。粘粒的結構特點：１、 含有抗藥性標記和質粒復制起始位點；２、 一個或多個單一限制酶切位點；３、 帶有λ噬菌體粘性末端；４、 分子小（4-6kb）,可容納大到40-50kb的外源DNA片段，因此適于構建真核生物基因組DNA文庫。六、酵母人工染色體 載體酵母人工染色體由酵母染色體的著絲粒(cen4)、自主復制序列(ARS1)和來自四膜蟲的端粒(Tel)等功能性DNA序 列組成。它可攜帶長達200-1000kb的DNA片段，因此在人基因組DNA大片段的克隆中非常有用，是染色體克隆排序的主要 工具。用酵母人工染色體克隆DNA的過程與λ噬菌體相似，將DNA大片段與載體的兩臂相聯，然后將連接混合物轉化進酵母細胞中， 利用載體上的選擇性標記進行篩選。

第三節 目的基因的獲取 一、通過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包括兩類：基因組文庫和cDNA文庫，兩種文庫的建庫過程不同，產生的基因結構也不同， 因此應用范圍也不相同。（一）、基因組文庫是含有某種生物體（或組織、細胞）全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體。用λ噬菌 體載體構建基因組文庫的基本步驟：１、 準備載體DNA(如置換型λ噬菌體載體)，用適當的限制酶消化并分離得到載體的左右兩臂；２、 純化真核細胞高分子量DNA，并用適當的限制酶部分消化；３、 分離適當大小的基因組DNA片段（20-24kb）；４、 連接載體與外源ＤＮＡ；５、 連接產物體外包裝及感染；６、 基因組文庫的擴增。由于基因組文庫包含了染色體的所有隨機片段形成的重組DNA克隆，因此，利用適當的篩選方法，就可以從中找出 攜帶所需目的基因片段的重組克隆。（二）、cDNA文庫 cDNA是指以mRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下形成的互補DNA. 以細胞的全部mRNA逆轉錄合成的cDNA組成的重組克隆群體稱為cDNA文庫。從cDNA文庫可以獲得較完整的連續編碼序列（ 不含內含子），便于表達成蛋白質。構建cDNA文庫的主要步驟：１、 mRNA分離；２、 cDNA第一鏈合成；３、 cDNA第二鏈合成；４、 載體與cDNA的連接; ５、 噬菌體的包裝及轉染；６、 cDNA文庫的擴增和保存。二、化學合成法制備DNA片段主要用于一些小的DNA 片段的合成。三、聚合酶鏈反應法擴增基因片段對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應（ＰＣＲ），以基因組D NA或cDNA模板擴增得到目的基因片段。

 第四節 DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組DNA技術的關鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。一、DNA連接酶 DNA連接酶催化兩年雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自 Ｔ４噬菌體的DNA 連接酶：T4 DNA連接酶，該酶需要ATP作為輔助因子。 T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于：１、 連接具有同源互補粘性末端的ＤＮＡ片段；２、 連接雙鏈DNA分子間的平端；３、 在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。二、粘性末端連接如果載體和插入片段具有相同的粘性末端，則很容易用DN A連接酶連接成環狀的重組DNA分子，但是要注意當載體和插入的兩個末端均為同源的粘性末端時，連接后可能出現以下問題：１、 載體自身環化，造成假陽性背景克隆，為避免此問題，可在連接前，用堿性磷酸酶將載體DNA 5’- 端去磷酸化，這樣只有載體和插入片段之間才能發生連接；２、 插入片段可雙向插入；３、 插入片段可多拷貝插入。當DNA片段兩端為非同源的粘性末端時，可實現定向克隆，這時的連接效率非常高，是重組方案中最有效、簡 捷的途徑。三、平端連接平端連接的優點是可用T4連接酶連接任何DNA平端，這對不同DNA分子的連接十分有利。因為除了相同或 不同限制酶酶切產生的平末端分子外，含3’-或5’-突出的粘性末端也可以被補齊或削平，實現平端連接。（一）、5’-突出粘性 末端的補齊限制酶降解產生的5’-端突出的粘性末端，可用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段（klenow片段）補齊。（二）、3 ’-突出粘性末端的削平含3’- 突出的粘性末端可用T4 DNA聚合酶的3’→5’外切核酸酶活性補平。平端連接的主要問題是，它的連接效率比粘性末端低，因此需較多的T4 DNA連接酶和較高的底物濃度，聚乙二醇（ＰＥＧ）可促進平端連接反應。四、人工接頭連接對平端DNA片段，可借助人工合成的接 頭來方便連接。所謂接頭是人工合成的至少８個核苷酸長的一段迥文序列。接頭是平端，在磷酸化后通過T4 DNA連接酶可與大多數平端DNA連接。連接后用相應的限制性內切酶切割，可產生所需要的粘性末端。五、利用適配子連接適配子是 人工合成的具有一個以上限制酶識別位點的短序列，它具有一個平端，可與其它DNA的平端連接，同時它還有某種限制酶的突出端，可 與含互補的限制酶突出端的DNA片段連接，連接后，用適當的限制酶切割又可產生所需要的突出粘端。

第五節 重組DNA導入宿主菌 體外連接的重組DNA分子必須導入適當的受體細胞中才能大量的復制、增殖和表達。根據所采用的載體的性質，將重組DNA分子導入 受體可有不同的方法。一、轉化 指以細菌質粒為載體，將外源基因導入受體細胞的過程。轉化時，細菌必須經過適當的處理使之處于感受態－即容易接受外源DNA的狀 態，然后利用短暫熱休克使DNA導入細菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉化細菌，它的優點是操作簡便、轉化效率高、適用于任何菌株 。二、轉染和感染利用噬菌體DNA作為載體時可經兩種方式導入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后 使其感染受體菌。另一種方式是轉染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環化，再象重組質粒一樣地轉化進受體菌。但習慣上常把 以噬菌體DNA為載體構建成的重組子導入細胞的過程統稱為轉染。 第六節 重組克隆的篩選與鑒定 基因克隆的最后一步是從轉化細菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過細菌培養以及重組子的擴增，獲得 所需的基因片段的大量拷貝。進一步研究該基因的結構、功能，或表達該基因的產物。一、抗藥性標志的篩選如果克隆載體帶有某種抗藥 性標志基因如ampr或tetrr ，轉化后只有含這種抗藥基因的轉化子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉化菌與非轉化菌區別開來。如果重 組DNA時將外源基因插入標志基因內，該標志基因失活，通過有無抗菌素培養基對比培養，還可區分單純載體或重組載體（含外源基因 ）的轉化菌落。二、β－半乳糖苷酶系統篩選很多載體都攜帶一段細菌的lacZ基因，它編碼β－半乳糖苷酶N-端的146個氨基酸 ，稱為α－肽，載體轉化的宿主細胞為lacZΔ15基因型，它表達β－半乳糖苷酶的C-端肽鏈，當載體與宿主細胞同時表達兩個片 段時，宿主細胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal 變為蘭色化合物，這就是所謂的α－互補，而重組子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互補，在含X-gal的平板上，含 陽性重組子的細菌為無色菌落或噬菌斑。三、菌落快速裂解鑒定法從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質粒大小，判斷有無 插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。四、內切酶圖譜鑒定經初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養后，再分離出重組質粒 或重組噬菌體DNA,用相應的內切酶切割，釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內切酶消化鑒定插入的方向。五 、通過聚合酶鏈反應篩選重組子一些載體的外源DNA插入位點兩側存在特定的序列，如啟動子序列等，利用這些特異性序列作為引物， 對小量制備的質粒DNA進行聚合酶鏈反應（PCR）分析，不但可迅速擴增插入片斷，判斷是否陽性重組子，還可直接對插入進行DN A 序列分析。六、菌落或噬菌斑原位雜交它是先將轉化菌落或噬菌斑直接鋪在硝酸纖維素膜或瓊脂平板上，再轉移至另一膜上，然后用標記 的特異DNA探針進行分子雜交，挑選陽性菌落。該法能進行大規模操作，一次可篩選多達5x105-5x106個菌落或噬菌斑，特 別適于從基因文庫中挑選目的基因。