第一節 DNA的復制(DNA Replication)

一、DNA復制的基本特性 1. 半保留性(Semi-Conservative) Meselson-Stahl實驗 2. 雙向復制(一般) 復制起始點(origin)+兩側復制叉=復制單位(復制子, Replicon) 3.半不連續性(Semi-discontinuous) 前導鏈(leading strand)-連續合成隨從鏈(Lagging Strand)-不連續,由崗崎片段(okazaki fragment)連接而成.

二、DNA復制必需的成份(真核生物) 1.染色體DNA復制必需三種核苷酸序列①復制起點②著絲粒③端粒. 2． RNA引物(RNA Primer) 一般8-14nt.帶游離3 -OH末端. 3.參加DNA復制的主要酶和蛋白質 ① DNA聚合酶(DNA Polymerase) 真核DNA復制的主要酶DNA Pol a/δ. 功能:從5 -3 方向延伸與模板互補的子代鏈. ②引發酶(Primase) 與其他多種蛋白組成多蛋白復合體-引發體(Primosome).催化RNA引物合成和復制起始. ③DNA連接酶(DNA Ligase) 催化一個雙鏈DNA的5 磷酸與另一雙鏈DNA的3 -OH形成磷酸二酯鍵. ④DNA解鏈酶(DNA Helicase),打開DNA雙鏈. ⑤增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen.PCNA) 輔助催化前導鏈合成. ⑥端粒酶(Telomerase) 末端復制問題。 端粒酶負責染色體末端(端粒)復制,是由RNA和蛋白質組成的核糖核蛋白.其中的RNA成分是端粒復制的模板.(因此端粒是逆轉 錄酶) 作用:維持端粒長度. 端粒酶活性可用基于PCR的“TRAP”（Telomerase repeat amplification protocol）法測定（Kim,N et al.,science,266,2011-2014(1994) 端粒與細胞壽命。端粒、端粒酶與腫瘤的關系：絕大多數惡性腫瘤具有端粒酶活性但端粒縮短，但也有約5%的腫瘤無端粒酶活性且端粒 較長。端粒酶作為新的腫瘤標志和腫瘤治療靶點.

第二節 DNA修復（DNA repair） DNA修復是維持基因組完整性的重要機制，在保護基因組避免發生可能導致腫瘤或遺傳疾病的突變中起關鍵的作用。引起DNA損傷的 因素： 1、 細胞內源性損傷因素： DNA復制錯誤；自發損傷包括堿基互變異構、堿基脫氨（C→U、A→I）和堿基丟失等；氧化代謝副產物如活性氧物質（React ive oxygen species，ROS）的攻擊等。 2、 環境中的損傷因素：輻射（含紫外線、X射線）產生胸腺嘧啶二聚體；化學致癌物（氧化脫氨，烷化劑或代謝活化物如苯并芘、黃曲霉素 等產生堿基加合物）一、堿基切除修復(Base excision repair、BER) 該途徑中最關鍵的是必須通過一種糖苷酶(glycosylase)先除去變異堿基(如被氧化、烷基化或脫氨的堿基)，該糖苷酶催 化連接損傷堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵水解，釋放游離堿基并在DNA中產生一個去堿基位點，然后由去嘌呤／去嘧啶(AP)核酸內 切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶等利用相對的一條正常鏈為模板進行修補合成。 BER途徑中的重要糖苷酶： (1)尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)，從DNA中除去尿嘧啶堿基； (2)3―甲基腺嘌吟(3MeA)DNA糖苷酶，可修復烷化劑產生的損傷； (3)負責修復DNA氧化損傷的糖苷酶（如Fpg／MutM DNA糖苷酶） BER是修復內源性DNA損傷(自發水解、烷基化和活性氧攻擊)的主要途徑，因此對于降低自發突變的頻率、防止腫瘤發生有重要作 用。二、核苷酸切除修復(Nucleotide excision repair，NER) 首先由多聚體復合物識別損傷，再在損傷的兩側進行切除。隨著DNA鏈被解開，包含損傷的單鏈片段釋放出來，留下的缺口由DNA聚 合酶填補，DNA連接酶封閉。該途徑包括20種以上蛋白，可以修復紫外輻射誘導的環丁烷嘧啶二聚體(CPD)和(6―4)光產物 ((6―4)PPs)，以及一些化學物質產生的大加合物。人的NER系統有關基因及其蛋白質產物功能。 NER系統缺陷與著色性干皮病（Xeroderm pigmentosum,XP） NER可再分為二條子途徑： (1)全基因組修復(Global Genomic repair，GGR)途徑：修復整個基因組內的損傷，其效率取決于損傷的化學特性、損傷部位的DNA序列和染色質結構。 (2)轉錄藕聯修復(Trancsription―coupled repair，TCR，)：特異地修復基因組中具有轉錄活性(即表達)的基因的被轉錄DNA鏈上的損傷，該途徑的 特點是依賴RNA聚合酶II催化的轉錄，其中的一些蛋白是普通轉錄因子TFIIH 的亞基。三、錯配修復(Mismatch repair) 負責修復DNA復制過程中由于錯誤摻入而產生的錯配。 STR序列復制-模板鏈的滑動產生小的環狀突出(loop)- 重復序列擴張（expansion）或丟失：微衛星不穩定性（microsatellite instability） E coli中的MMR途徑需要mutS,mutH,mutL和uvrD基因產物和特異性核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶等 。在酵母和人類已鑒定了mutS,mutH的多種同源物。遺傳性非息肉性結腸癌（HNPCC）基因缺陷。微衛性不穩定與腫瘤。新 的腫瘤基因診斷標志。四、重組修復(Recomhinant repair) 修復DNA的兩條鏈均受損傷的部位的雙鏈斷裂或鏈間交連。 Further readings: 1 Wood RD，DNA repair in eukaryotes，Ann Rev Biochem，1996，65：135―167 2 Krokan HE,et a1., DNA glycosylase in the base excision repair of DNA．Biochem J，1997，325：1―16 3 Vrieling H，et a1., Transcription coupled repair and its impact on mutagenesis，Mutation Res，1998，400：135―142

第三節 重組(recombination) 重組的本質是基因的重排或交換.即2個DNA分子間或一個DNA分子的不同部位間,通過斷裂和重接,交換DNA片段從而改變基因 的組合和序列.  一.同源重組(Homologous recombination) 指DNA同源序列間的重組,常發生于兩個較長的同源DNA片段或同源染色體之間。 可通過同源重組將外源基因定位整合到細胞基因組中.  二.轉座(transposition) 可移動的DNA元件(mobile DNA elements) -轉座元件(Transposable element).它是指那些可在DNA分子內或DNA分子間轉移的DNA片段. 轉座元件的轉移過程-轉座轉座的特點: 1.轉座后原來位置的轉座元件序列仍然保留,但同時又把新合成的DNA 復本插入到另外一個位點. 2.轉座過程需要轉座酶(transposase).它催化斷裂和重接兩步連續的 過程(需要M2+) 3.轉座元件插入位置的兩茶有3-12bp的正向重復序列(靶序列),它是由于轉座酶錯位切割DNA造成的.這種短正向重復序列 是存在轉座元件的特征. 轉座元件的分類 ①轉座子(transposon):通過DNA復制而轉移的轉座元件. ②逆轉座子(retroposon)或返座子,通過RNA階段實現轉移的轉座元件 (DNA→ RNA→ DNA→ 插入新位點) 逆轉座子例:Alu.LINE1.逆假基因(retro-pseudogene) 轉座的遺傳效應-導致基因重排、插入、缺失。